雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 基因工程
產(chǎn)品 說(shuō)明 ：
    報(bào)告基因檢測(cè)，是真核基因表達(dá)調(diào)控研究的常用方法。由于檢測(cè)光量子的方法非常敏感，采用生物發(fā)光(bioluminescent) 法，是報(bào)告基因檢測(cè)常用的有效手段。熒光素酶(luciferase) 催化底物熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)射出光子。螢火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly luciferase)和海腎熒光素酶(Ranilla luciferase) 催化的發(fā)光反應(yīng)，具有相似的光學(xué)特征和很好的濃度線性范圍(7~8 個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍) ，酶的檢測(cè)靈敏度達(dá) 10 -18 mol 到 10 -20 mol，
但兩者催化的化學(xué)反應(yīng)底物和適反應(yīng)條件*不同。這兩種熒光素酶配合形成了十分有效的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，其中 Ranilla luciferase 通常作為內(nèi)參照。
    本試劑盒提供了一體化形式的雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)。采用通用裂解緩沖液，適合于兩種熒光素酶活性的保持，且與其他類(lèi)型的報(bào)告基因檢測(cè)和蛋白含量檢測(cè)兼容；優(yōu)化的兩種酶反應(yīng)體系，使每種發(fā)光反應(yīng)持續(xù)數(shù)十分鐘， 以便于手工操作多個(gè)樣品； 并保證 Firefly luciferase 發(fā)光及時(shí)淬滅， 不影響后續(xù) Ranilla luciferase的測(cè)定；優(yōu)化的反應(yīng)體系還使兩種熒光素酶活性比值趨于合理的敏感范圍，更有利于后續(xù)數(shù)據(jù)的比較。

產(chǎn)品內(nèi)容：
名稱(chēng)  數(shù)量  保存條件
5x Universal Lysis Buffer (通用裂解液) 25 ml  -20 ℃
Fassay Buffer I (蟲(chóng)酶緩沖液)  10 ml  -20℃
Fassay Substrate I (蟲(chóng)酶底物)  0.5 ml  -20℃
Rassay Buffer II ( 海酶緩沖液)  10 ml  -20℃
Rassay Substrate II ( 海酶底物)  0.2 ml  -20℃
可作 100 次雙熒光素酶檢測(cè)。低溫運(yùn)輸，-20 ℃或-80 ℃避光保存。有效期 6 個(gè)月。
洚備試劑 ：
PBS、雙蒸水等。

操洽步驟 ：
一 、 裂解細(xì)胞 ：
1) 新鮮配制裂解液：臨用前，取適量 5xUniversal Lysis Buffer (ULB)，用雙蒸水稀釋 1xULB ，混勻。1xULB 可在 4℃存放數(shù)周。
2) 細(xì)胞清洗：傾去培養(yǎng)板/皿中的培養(yǎng)液，加入足量 PBS ，輕輕洗滌細(xì)胞。*傾去洗滌液。
3) 細(xì)胞裂解：推薦按照表中的體積，在孔/皿中加入 1xULB ，混勻。培養(yǎng)板可在微型振蕩器上震蕩 5~10min ；培養(yǎng)皿可直接用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入 1.5 ml 離心管，在渦旋振蕩器上充分混懸震蕩30 秒。裂解細(xì)胞懸液可直接用于發(fā)光測(cè)定，也可離心 30 秒，取上清做發(fā)光測(cè)定。
表：不同容器細(xì)胞所需 1xULB 的體積。
96 孔板 48 孔板 24 孔板 12 孔板 6 孔板 35 mm 平皿 60 mm 平皿
30µl  60µl  120µl 250µl 500µl  500µl  1000µl

二 、 配制發(fā)光反應(yīng)液 ：
測(cè)定前，在室溫待 Fassay Buffer I 、Fassay Substrate I 、Rassay Buffer II 和 Rassay Substrate II 溶化，混勻（注意避光）。按 20/1 比例用 Fassay Buffer I 稀釋 Fassay Substrate I ，按 50/1 比例用 Rassay Buffer II稀釋 Rassay Substrate II，分別配制所需體積的 Fassay Reagent I 和 Rassay Reagent II （注意避光）。

三 、 測(cè)定儀器的設(shè)置 ：
按儀器操作說(shuō)明開(kāi)啟發(fā)光測(cè)定儀。手動(dòng)操作型儀器，將測(cè)讀時(shí)間設(shè)為 10~20 秒。自動(dòng)操作型儀器，一般將測(cè)定延遲設(shè)為 2 秒，將測(cè)讀時(shí)間設(shè)為 10~20 秒，F(xiàn)assay Reagent I 和 Rassay Reagent II 的注入體積設(shè)定為 100 µl。

四 、 手動(dòng)發(fā)光測(cè)定 ：
取待測(cè)樣品 20 µl 加入測(cè)量管底部，取 Fassay Reagent I 100 µl 加入管底部，輕輕敲擊管壁 3~5 次混勻，放入儀器中立即測(cè)定，記錄發(fā)光值為 Firefly luciferase 的發(fā)光單位(RLU) ；
取 Rassay Reagent II 100 µl 加入管底部，輕輕敲擊管壁 3~5 次混勻，放入儀器中立即測(cè)定，記錄發(fā)光值為 Ranilla luciferase 的發(fā)光單位(RLU) 。如用多孔板同時(shí)手動(dòng)測(cè)定多個(gè)樣品，則將各待測(cè)樣品 20 µl 分別加入連續(xù)的各孔底部，用多道加樣器于各孔底加入 Fassay Reagent I 100 µl，輕輕敲擊板側(cè) 3~5 次混勻，放入儀器中立即測(cè)定，記錄發(fā)光值為 Firefly luciferase 的發(fā)光單位(RLU) ；取 Rassay Reagent II 100 µl 立即加入管底部， 輕輕敲擊板壁3~5次混勻， 放入儀器中立即測(cè)定， 記錄發(fā)光值為Ranilla luciferase的發(fā)光單位(RLU) 。

五 、 自動(dòng)發(fā)光測(cè)定 ：
配制好的 Fassay Reagent I 和 Rassay Reagent II 置于測(cè)定儀內(nèi)并連接好對(duì)應(yīng)管道， Fassay Reagent I 接*注射管道，Rassay Reagent II 接第二注射管道。各待測(cè)樣品 20 µl 分別加入測(cè)定管/板孔底部，啟動(dòng)自動(dòng)測(cè)量程序。記錄 Firefly luciferase 和 Ranilla luciferase 的發(fā)光單位(RLU) 。

注意事項(xiàng) ：
1) Fassay Buffer I 和 Fassay Substrate I 應(yīng)避免反復(fù)凍熔，可分裝成合適體積分次使用。Rassay Substrate II溶液應(yīng)蓋嚴(yán)存放， 避免蒸發(fā)。 配制好未用完的 Fassay Reagent I 和 Rassay Reagent II 可在-20℃保存 1 月左右。
2) 細(xì)胞裂解液一般在當(dāng)天測(cè)定。如需隔日測(cè)定，應(yīng)將樣品于-20℃保存。長(zhǎng)期保存應(yīng)在-80℃。測(cè)定樣品量可為 10~30µl。
3) 用多孔板同時(shí)手動(dòng)測(cè)定多個(gè)樣品時(shí)，要盡量保證每個(gè)樣品的兩種試劑加入時(shí)間間隔*。
4) Rassay Reagent II 可用于直接測(cè)定樣品的 Ranilla luciferase 。需要注意的是，Rassay Reagent II 直接測(cè)量的 RLU 要比雙熒光素酶順序檢測(cè)獲得的 RLU 高一些（反應(yīng)體積等因素的影響）。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Long non-coding RNA MBNL1-AS1 regulates proliferation, migration, and invasion of cancer stem cells in colon cancer by interacting with MYL9 via sponging microRNA-412-3p》 作者:Kongxi Zhu，Yunxia Wang，Lan Liu，Shuai Li，Weihua Yu 期刊:Clinics and Research in Hepatology and Gastroenterology 影響因子:2.807 PMID:31255531
《Effects of Srxn1 on growth and Notch signalling of astrocyte induced by hydrogen peroxide》 作者:Lan Li, Guangjun Lin, Huizi Gu, Lei Yu & Changwei Ni 期刊:Artificial Cells, Nanomedicine, and Biotechnology 影響因子:4.462 PMID:31079497
 

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